| 基于高效液相色谱技术的代谢组学方法用于痛风生物标记物的研究 | |
| 刘芸 | |
| Subtype | 理学博士 |
| Thesis Advisor | 邸多隆 |
| 2013-06-01 | |
| Degree Grantor | 中国科学院大学 |
| Department | 中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 |
| Degree Discipline | 分析化学 |
| Keyword | 代谢组学 痛风 生物标记物 高效液相色谱法 化学计量学 Metabonomics Gout Disease Biomarkers High Performance Liquid Chromatography Chemometris |
| Abstract | 代谢组学（metabonomics）由于能够直接、动态的反映生命状态的发展变化，已广泛应用于临床疾病生物标记物筛选的研究中，如消化系统疾病、内分泌系统疾病及各个系统肿瘤的研究。痛风是由一组嘌呤代谢紊乱和尿酸排泄障碍所致的疾病。目前，临床上生化检测痛风仅包含尿酸一个指标。由于指标单一，痛风常被误诊为其它疾病，如急性风湿性关节炎、假性痛风等。针对痛风临床检测指标单一、误诊率高，及该疾病反复发作、无规律的特点，本论文运用代谢组学的方法并结合化学计量学的数据处理手段，研究了痛风患者血清和尿液中全部内源性代谢物质的变化，通过寻找新的潜在生物标记物，可以实现对痛风疾病的早期预报、诊断和治疗。具体研究内容如下： 1.首先考察了生物样品（血清和尿液）用于生物标记物筛选研究时，样品处理方法的有效性及储存温度和存储时间的影响。采用高效液相色谱-二极管阵列检测（High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detector，HPLC-DAD）技术建立了血清和尿液的代谢轮廓图谱，结合主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和峰面积变化值（PC）等指标比较了样品不同制备方法之间的差异。结果表明：细菌的存在能够影响血清和尿液中代谢物质的含量，样品经沉淀蛋白后在氮气保护下挥干水分，直接存储于-20 ℃，即可明显减弱细菌的酶解转换作用，可在一定程度上使样品保持在原始状态。当用于代谢组学分析时，尿液样品的存储时间较血清样品长些。经蛋白沉淀、挥干后，在-20 ℃ 的条件下存储两个月，血清和尿样的平均PC值均小于 15%，因此可用于临床分析。 2.采用基于HPLC-DAD技术的代谢轮廓分析并结合化学计量学手段研究了正常组、急性痛风组和慢性痛风组的血清和尿液代谢指纹图谱变化，采用无监督的 PCA 和有监督的正交信号滤-偏最小二乘判别分析（Orthogonal Signal Correction Partial Least Squares Discriminate Analysis，OSC-PLS-DA）从血清（27个）和尿液（39 个）指纹图谱的共有峰中提取了各组的分类信息。结果表明，血清中的肌酐、尿酸和色氨酸以及尿液中的肌酐、尿酸、鸟苷和马尿酸可以作为区分痛风和正常人的潜在生物标记物，并且基于所选标记物建立的化学计量学模型能够判断疾病的严重程度。急性痛风和慢性痛风相比，急性痛风的代谢紊乱程度更为严重，且伴有能量代谢异常和色氨酸代谢紊乱。在痛风疾病的研究中，本论文首次发现了痛风疾病伴有色氨酸的代谢紊乱。 3.采用代谢靶标分析与多维统计分析（Fisher Discriminate Analysis，FDA和OSC-PLS-DA）方法寻找痛风病人尿液中的生物标记物。基于前一部分代谢轮廓分析的实验结果，选取了 15 种内源性代谢物质用于尿液的代谢靶标分析。多维分析结果表明：尿样中对急性痛风、慢性痛风和对照组影响显著的生物标记物为尿酸、次黄嘌呤、黄苷、鸟苷、次黄苷和色氨酸。结合高尿酸血症模型的小鼠实验，本研究首次证明了色氨酸的代谢紊乱是由痛风疾病本身引起的，而与别嘌醇等降尿酸药物无关。基于所选标记物，采用 OSC-PLS-DA 统计学分析方法得到了判别方程，该方程对急性痛风的识别和预测能力分别为 100%和 83.3%，对慢性痛风的分别为90.9%和89.9%。该方法能够方便地辨别是否为痛风疾病以及评价疾病所处的阶段。 4.采用代谢靶标分析方法从血清样品中寻找痛风疾病的生物标记物。图解指数分离（Graphical index of separation，GIOS）和子窗口置换分析（Subwindow permutation analysis，SPA）两种新型的多维统计分析方法用于从血清靶标代谢物质中选择重要变量，并与传统的变量重要性方法（Very important projection，VIP）进行了对比。结合痛风的代谢途径和三种算法的结果，最终确定痛风/非痛风组中的重要变量为尿酸、尿嘧啶、次黄苷、腺苷和色氨酸；急性/慢性痛风组中为尿酸、尿嘧啶、苯丙氨酸、色氨酸和腺嘌呤。该研究结果与尿液的代谢靶标分析结果对应较好。在痛风/非痛风组中，尿酸单一指标的识别能力为 0.79，而基于重要变量建立的 PLS-DA 模型的识别能力为 0.98；在急性/慢性组中，尿酸的识别能力仅为0.62，而所建模型的识别能力为0.90。相比于痛风的单一评价指标尿酸，所建立的 PLS-DA 模型对痛风/非痛风组和急性/慢性组的识别和预测能力均得到了显著提高。本研究首次确定了痛风疾病中尿嘧啶的代谢异常，这与代谢轮廓分析中所选标记物 P6 峰相一致，同时表明变量选择结合化学计量学方法能够为临床上痛风疾病的早期诊断提供预报预警平台。 |
| Funding Project | 药物工艺标准研究组 |
| Document Type | 学位论文 |
| Identifier | http://ir.licp.cn/handle/362003/5564 |
| Collection | 中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 |
| Recommended Citation GB/T 7714 | 刘芸. 基于高效液相色谱技术的代谢组学方法用于痛风生物标记物的研究[D]. 中国科学院大学,2013. |
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| 201315刘芸.pdf（2840KB） | 开放获取 | CC BY-NC-SA | View Application Full Text | |||
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