| 固定化酶的制备及其酶抑制剂筛选的研究 | |
| Alternative Title | 无 |
| 刘冬梅 | |
| Thesis Advisor | 陈娟 |
| 2018-05-21 | |
| Degree Grantor | 中国科学院大学 |
| Place of Conferral | 北京 |
| Degree Name | 理学博士 |
| Degree Discipline | 分析化学 |
| Keyword | 压力中介微分析 固定化酶 磁性载体 酶动力学研究 抑制剂筛选 Pressure mediated microanalysis Immobilized enzyme Magnetic immobilization carrier Enzyme kinetic and inhibition study Enzyme inhibitor screening |
| Abstract | 酶抑制剂可有效降低疾病相关酶的活性，从而进行疾病的防治，目前已有许多酶抑制剂类药物用于相关疾病的治疗。植物、传统中药、食品等资源丰富、环境友好，是酶抑制剂的主要来源。毛细管电泳具有样品用量少、分离效率高、耗时短等特点，为酶动力学研究及酶抑制剂快速筛选提供了基础。本论文以糖尿病的治疗靶标α-葡萄糖苷酶和黑色素生物合成的关键酶及限速酶酪氨酸酶为研究对象，利用产物特征紫外吸收，发展了在线压力中介微分析方法用于酶促反应动力学及抑制动力学研究。此外，以易分离的磁性纳米粒子和纤维素滤纸为酶固定化载体，制备固定化酶，结合毛细管电泳，用于酶促反应动力学和抑制动力学研究及酶抑制剂的分析筛选研究。主要内容如下: （1）毛细管固定化α-葡萄糖苷酶微反应器的制备及其动力学研究。针对α-葡萄糖苷酶酶促反应体系与分离体系不相兼容的问题，首次结合毛细管固定化酶和压力中介微分析法，实现固定化α-葡萄糖苷酶的在线研究。以3-氨丙基三乙氧基硅烷为氨基改性剂，修饰毛细管内壁使其富含氨基；以戊二醛为偶联试剂，利用席夫碱反应，在氨基化的毛细管内壁修饰醛基；再次利用席夫碱反应，实现α-葡萄糖苷酶于毛细管内壁的固定。以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物，施加压力将反应混合物推送至检测窗口，利用产物4-硝基苯酚在405nm处的特征紫外吸收实现检测，从而进行酶促反应动力学和抑制动力学的研究。首次实现了固定化α-葡萄糖苷酶的在线研究。 （2）磁性壳聚糖纳米粒子固定化α-葡萄糖苷酶的制备、性能研究及酶抑制剂的筛选。利用产物特征紫外吸收进行测定，对待筛选物要求比较严苛，需要其在405nm处不对产物检测产生干扰，因此不能用于酶抑制剂的筛选。针对此问题，以磁性纳米粒子为载体，壳聚糖为氨基改性剂，戊二醛为偶联剂，利用席夫碱反应将α-葡萄糖苷酶固定于磁性壳聚糖纳米粒子表面。通过优化酶固定过程中各条件，得到催化活性良好的固定化酶；对固定化酶的最适酶促反应pH值和温度进行考察，并与游离酶相比较；在最适反应条件下，对固定化酶进行重复使用性及储存稳定性考察并与游离酶相比较。对固定化酶进行酶促反应动力学和抑制动力学研究，并由18种中药提取物中进行了酶抑制剂的筛选。 （3）磁性壳聚糖复合物固定化α-葡萄糖苷酶的制备、性能研究及酶抑制剂的筛选。由于磁性壳聚糖纳米粒子制备过程繁琐且酶催化产物峰面积小，因此采用简单的包埋法制备高含量壳聚糖磁性复合物用以α-葡萄糖苷酶的固定，从而简化操作步骤，提高酶的固载量，进而增加产物峰面积。以高含量壳聚糖磁性复合物为载体，戊二醛为偶联试剂，利用席夫碱反应实现α-葡萄糖苷酶的固定。对高含量壳聚糖磁性复合物上α-葡萄糖苷酶的固载量进行考察，并与磁性壳聚糖纳米粒子上α-葡萄糖苷酶的固载量进行比较，结果发现高含量壳聚糖磁性复合物可以固载更多的酶。对固定化酶进行性能考察，并与游离酶相比较。对固定化酶进行酶促反应动力学和抑制动力学研究，并由11种中药和9种蔬菜提取物中进行了酶抑制剂的筛选。 （4）氨基磁性纳米粒子固定化酪氨酸酶的制备、性能研究及酶抑制剂的筛选。为了避免酶分子在固定过程中活性构象发生变化，结合物理吸附和共价交联的优势将酪氨酸酶固定于氨基磁性纳米粒子上，结合毛细管电泳实现酶抑制剂的筛选。以氨基磁性纳米粒子为载体，酪氨酸酶首先通过静电作用吸附在磁性载体上，然后以戊二醛为交联剂，利用席夫碱反应将吸附于载体表面的酪氨酸酶共价交联于载体上。以L-酪氨酸为底物，L-抗坏血酸为抗氧化剂，通过检测产物左旋多巴而进行活性测定。对固定化酪氨酸酶进行动力学研究及性能考察，并由11种中药提取物中进行了酶抑制剂的筛选。 （5）纤维素滤纸固定化α-葡萄糖苷酶的制备、性能研究及酶抑制剂的筛选。酶固定化磁性载体必须在外加磁场作用下分离，具有一定的延时性，不能实现即时分离；此外，由于磁性纳米粒子高的表面能和范德华力，磁性固定化酶在操作及储存过程中易于团聚。针对这些问题，以价格低廉、无需制备、可即时分离的纤维素滤纸为载体，以壳聚糖为氨基改性剂，戊二醛为偶联试剂，利用席夫碱反应实现α-葡萄糖苷酶的制备。对纤维素滤纸固定化α-葡萄糖苷酶进行动力学研究及性能考察，并由11种中药提取物中进行了酶抑制剂的筛选。结果表明，纤维素滤纸作为一种新型的酶固定化载体具有潜在的发展前景。 （6）压力中介微分析法用于酪氨酸酶酶促反应动力学及抑制动力学研究。首次使用新型、无需施加电压的在线分析技术-压力中介微分析法对酪氨酸酶进行研究，实验中以左旋多巴为底物，顺序进样反应物，使用压力将反应混合物推送至检测窗口，利用产物多巴醌在475nm处的特征紫外吸收实现检测，从而进行酶促反应动力学及抑制动力学研究。将所建立的压力中介微分析法与紫外-分光光度法和电泳中介微分析比较，结果具有可比性，这为酶促反应动力学及抑制动力学研究提供了一种新型方法。 |
| Other Abstract | 无 |
| Document Type | 学位论文 |
| Identifier | http://ir.licp.cn/handle/362003/26335 |
| Collection | 中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 中国科学院兰州化学物理研究所 |
| Affiliation | 1.中国科学院兰州化学物理研究所; 2.中国科学院大学 |
| Recommended Citation GB/T 7714 | 刘冬梅. 固定化酶的制备及其酶抑制剂筛选的研究[D]. 北京. 中国科学院大学,2018. |
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